Die Isothermale Titrationskalorimetrie (ITC) ist ein Verfahren, das bei quantitativen Untersuchungen verschiedenster biomolekularer Wechselwirkungen eingesetzt wird. Es basiert auf der direkten Messung der W?rme, die bei einem biomolekularen Bindungsereignis entweder abgegeben oder aufgenommen wird.

Die ITC ist das einzige Verfahren, mit dem alle Bindungsparameter in einem einzigen Experiment simultan bestimmt werden k?nnen. Es erfordert keine Modifikation der Bindungspartner, weder mit Fluoreszenzmarkern noch durch Immobilisierung. Die ITC misst die Affinit?t von Bindungspartnern in ihrem nativen Zustand.

Die Messung der W?rmeübertragung w?hrend der Bindung erm?glicht die genaue Bestimmung der Bindungskonstanten (KD), der Reaktionsst?chiometrie (n), der Enthalpie (?H) und der Entropie (ΔS). Diese Werte liefern ein komplettes thermodynamisches Profil der molekularen Wechselwirkung. über die Bindungsaffinit?ten hinaus kann die ITC die Mechanismen aufkl?ren, die den molekularen Wechselwirkungen zugrunde liegen. Dieses tiefere Verst?ndnis der Struktur-Funktions-Zusammenh?nge erm?glicht fundiertere Entscheidungen bei der Hitauswahl und Leitstrukturoptimierung.

Messprinzip

Die Isothermale Titrationskalorimetrie wird zur Untersuchung von Reaktionen zwischen Biomolekülen verwendet. Das Verfahren erm?glicht die Bestimmung der Bindungsaffinit?t, der St?chiometrie und der Entropie und Enthalpie der Bindungsreaktion in L?sung, ohne dass Markierungen ben?tigt werden.

Wenn die Bindung erfolgt, wird W?rme entweder aufgenommen oder abgegeben. Dieser Vorgang wird durch das empfindliche Kalorimeter w?hrend der stufenweisen Titration des Liganden in die Probenzelle gemessen, die das zu untersuchende Biomolekül enth?lt.

Isotherme Titrationskalorimetrie

Funktionsweise

Die thermische Messkammer

Das Mikrokalorimeter verfügt über zwei Zellen, von denen eine Wasser enth?lt und als Referenzzelle dient und die andere die Probe enth?lt. Das Mikrokalorimeter muss diese beiden Zellen auf exakt gleicher Temperatur halten. Wenn die Bindung erfolgt, erkennen die Temperatursensoren einen Temperaturunterschied zwischen den Zellen. Dieser Messwert wird als Steuergr??e an die Heizung geführt, um den Unterschied zu kompensieren und die Zellen wieder auf gleiche Temperatur einzustellen.

Durchführen einer Messung

Referenzzelle und Probenzelle werden auf die gewünschte Experimenttemperatur eingestellt. Der Ligand wird in eine Spritze geladen, die sich in einer sehr genauen Injektionsvorrichtung befindet. Die Injektionsvorrichtung wird in die Probenzelle eingeführt, die das zu untersuchende Protein enth?lt. Nun wird in die Proteinl?sung eine Reihe kleiner Aliquoten des Liganden injiziert. Wenn eine Bindung des Liganden an das Protein erfolgt, werden Temperaturschwankungen von wenigen millionstel Grad Celsius erkannt und gemessen.

Ab der ersten Injektion misst das Mikrokalorimeter die gesamte abgegebene W?rme, bis die Bindungsreaktion das Gleichgewicht erreicht hat.? Die gemessene W?rmemenge ist direkt proportional zum Bindungsgrad.

Ergebnisse und Datenanalyse

Im folgenden Beispiel ist die Reaktion exotherm, d.?h., die Probenzelle wird w?rmer als die Referenzzelle, wodurch das Signal einen Peak nach unten aufweist. Wenn die Temperatur der beiden Zellen wieder gleich ist, kehrt das Signal in seine Ausgangsposition zurück. Das zweite kleine Aliquot des Liganden wird in die Probenzelle injiziert, und erneut kompensiert das Mikrokalorimeter die geringe detektierte W?rmemengen?nderung. Das molare Verh?ltnis zwischen Ligand und Protein wird durch eine Reihe von Ligandeninjektionen schrittweise erh?ht. Das Protein wird immer mehr ges?ttigt, sodass weniger Bindungen des Liganden erfolgen und die W?rmemengen?nderungen beginnen, abzunehmen, bis die Probenzelle schlie?lich einen überschuss des Liganden gegenüber dem Protein enth?lt und die Reaktion in die S?ttigung geht.

Isotherme Titrationskalorimetrie

Die einzelnen Peakfl?chen werden anschlie?end integriert und gegenüber dem molaren Verh?ltnis zwischen Ligand und Protein aufgetragen. Die resultierende Isotherme kann an ein Bindungsmodell angepasst werden, von dem die Affinit?t (KD) abgeleitet wird. Das molare Verh?ltnis im Zentrum der Bindungsisotherme gibt die Reaktionsst?chiometrie an. Das unten gezeigte Diagramm ist ein Beispiel einer 1:1 Bindungsreaktion.

Isotherme Titrationskalorimetrie

Die Enthalpie (ΔH) kann ebenfalls direkt aus der Isotherme abgeleitet werden. Sie entspricht der abgegebenen W?rmemenge pro Mol des gebundenen Liganden. Somit liefert ein einziges ITC-Experiment eine Fülle von Informationen über die Bindungsreaktion und hilft damit, die Art der Wechselwirkung und die thermodynamischen Ursachen zu verstehen.

Die ITC wird in der Erforschung und Entwicklung von Arzneimitteln weithin für folgende Zwecke eingesetzt:

  • Quantifizierung der Bindungsaffinit?t
  • Kandidatenauswahl und -optimierung
  • Messung der Thermodynamik und der aktiven Konzentration
  • Charakterisierung des Wirkmechanismus
  • Best?tigung geplanter Bindungsziele in der Erforschung niedermolekularer Arzneimittel
  • Bestimmung der Bindungsspezifit?t und St?chiometrie
  • Validierung der IC50 und EC50 Werte beim Hit-to-Lead-Prozess
  • Messung von Enzymkinetiken

MicroCal PEAQ-ITC

MicroCal PEAQ-ITC Automated

MicroCal PEAQ-ITC MicroCal PEAQ-ITC Automated

Hochempfindliche Messung aller Bindungsparameter.

Hochproduktive Messung mehrerer Bindungsparameter.

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Typ der Messung
Markierungsfreie Analyse
Bindungsaffinität
Technologie
Isothermale Titrationskalorimetrie (ITC)
Probendurchsatz 8 per 8h day - 12per 8h day x per 24h day - 42per 24h day
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